GABARAP CRISPR Activation Plasmid (h): sc-416746-ACT

GABARAP (GABA-Rezeptor-assoziiertes Protein) ist ein ubiquitinähnliches Mitglied der ATG8-Familie, das die Autophagie reguliert, indem es die Reifung von Autophagosomen, die Rekrutierung von Fracht sowie die Fusion mit Lysosomen durch Interaktionen mit Proteinen fördert, die eine LC3-interagierende Region (LIR) enthalten. Es trägt außerdem zum intrazellulären Membrantransport und zur Rezeptor-Clusterbildung bei und verknüpft so den autophagischen Fluss mit vesikulärem Transport und der Organisation des Zytoskeletts. Eine Fehlregulation GABARAP-assoziierter Signalwege ist relevant für Störungen der Proteostase, neurodegenerative Prozesse und die Stressadaptation von Krebszellen, bei denen veränderte Autophagie Überlebenssignale und metabolische Umprogrammierung beeinflussen kann. Als kompaktes Gerüstprotein mit vielen Bindungspartnern wird GABARAP häufig untersucht, um Mechanismen der selektiven Autophagie und der Qualitätskontrolle von Organellen aufzuklären.

GABARAP Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen GABARAP-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

GABARAP Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des GABARAP-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der GABARAP-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen GABARAP-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native GABARAP-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von GABARAP-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des GABARAP-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem GABARAP-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.