Plasmide CRISPR d'Activation (h) GABA T-3: sc-403545-ACT

SLC6A11 code pour le transporteur humain du GABA 3 (GAT-3), un transporteur membranaire dépendant du Na⁺/Cl⁻ qui élimine l’acide γ-aminobutyrique (GABA) de l’espace extracellulaire et module la neurotransmission inhibitrice. En régulant la disponibilité synaptique et extrasynaptique du GABA, GAT-3 influence l’homéostasie du chlorure, l’excitabilité neuronale et les oscillations des réseaux, et il est fonctionnellement couplé au shunt du GABA, qui relie le recyclage des neurotransmetteurs au métabolisme cellulaire. L’activité de SLC6A11 s’intègre aux interactions métaboliques astrocyte–neurone et aux processus de transport qui ajustent la recapture des neurotransmetteurs et la signalisation synaptique. Une recapture du GABA dérégulée et une expression modifiée de SLC6A11 ont été étudiées dans le contexte de phénotypes neuropsychiatriques et neurodéveloppementaux où l’équilibre des circuits inhibiteurs est perturbé.

GABA T-3 Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de SLC6A11 sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

GABA T-3 Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus SLC6A11 dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription SLC6A11, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de GABA T-3. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus SLC6A11 natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de GABA T-3 au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie GABA T-3 dans les cellules tumorales présentant une expression de SLC6A11 silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.