G9a CRISPR Activation Plasmid (h): sc-402484-ACT

EHMT2 kodiert die humane Histon-Lysin-Methyltransferase G9a, einen zentralen „Writer“ für H3K9me1/2-Markierungen, die fakultatives Heterochromatin und transkriptionelle Repression fördern. G9a arbeitet mit GLP, HP1-Proteinen und der DNA-Methylierungsmaschinerie zusammen, um die Chromatinzugänglichkeit zu formen und während Entwicklung und Differenzierung linienspezifische Genexpressionsprogramme zu stabilisieren. Über die Regulation von Zellzykluskontrolle, DNA-Schadensantworten sowie metabolischen und inflammatorischen Transkriptionsnetzwerken beeinflusst EHMT2 mehrere Signalwege, die mit epigenetischer Homöostase verknüpft sind. Eine fehlregulierte G9a-Aktivität und veränderte H3K9-Methylierungsmuster wurden mit Tumorbiologie, neuroentwicklungsbezogenen Phänotypen und immunassoziiertem transkriptionellem Remodeling in Verbindung gebracht, was die Relevanz von EHMT2 für mechanistische Krankheitsmodelle unterstreicht.

G9a Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen EHMT2-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

G9a Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des EHMT2-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der EHMT2-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen G9a-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native EHMT2-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von G9a-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des G9a-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem EHMT2-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.