G6PT CRISPR Activation Plasmid (h): sc-406483-ACT

Humanes SLC37A4 kodiert den Glukose-6-phosphat-Transporter (G6PT), ein Membranprotein des endoplasmatischen Retikulums, das Glukose-6-phosphat in das ER-Lumen importiert, um die Aktivität der Glukose-6-phosphatase und die metabolische Homöostase zu unterstützen. Dieser Transportschritt ist zentral für die Glykogenolyse und Glukoneogenese und verknüpft den zytosolischen Kohlenhydratfluss mit der im ER lokalisierten Phosphatverarbeitung und den Signalwegen der Glukoseproduktion. Die G6PT-Funktion beeinflusst die intrazelluläre Energiebilanz und zelluläre Antworten auf die Nährstoffverfügbarkeit, mit nachgelagerten Effekten auf den Neutrophilen- und Leberstoffwechsel. Pathogene SLC37A4-Varianten sind mit der Glykogenspeicherkrankheit Typ Ib assoziiert, wodurch dieser Genort für mechanistische Studien zur metabolischen Fehlregulation und zu immunbezogenen Phänotypen relevant ist.

G6PT Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen SLC37A4-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

G6PT Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des SLC37A4-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der SLC37A4-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen G6PT-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native SLC37A4-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von G6PT-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des G6PT-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem SLC37A4-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.