fumarate hydratase CRISPR Activation Plasmid (h): sc-401660-ACT

Das humane **FH**-Gen kodiert die Fumarathydratase (Fumarase), ein homotetrameres Enzym des Tricarbonsäurezyklus (TCA-Zyklus), das die reversible Hydratisierung von Fumarat zu L‑Malat katalysiert und damit den mitochondrialen Energiestoffwechsel mit Anaplerose und Redox-Homöostase verbindet. Über den zentralen Kohlenstofffluss hinaus beeinflussen Fumaratspiegel die zelluläre Signalgebung über Proteinsuccinierung sowie durch die Modulation epigenetischer und hypoxieassoziierter Programme und verknüpfen so die FH-Aktivität mit mitochondrialen Stressantworten und metabolischer Umprogrammierung. Störungen der FH-Funktion wurden mit onkogenem Stoffwechsel und einer veränderten Handhabung reaktiver Sauerstoffspezies in Verbindung gebracht, wodurch FH einen zentralen Knotenpunkt für die Untersuchung mitochondrialer Dysfunktion, metabolischer Checkpoints und Genom‑zu‑Metabolit‑Zusammenhänge in menschlichen Zellen darstellt.

fumarate hydratase Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen FH-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

fumarate hydratase Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des FH-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der FH-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen fumarate hydratase-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native FH-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von fumarate hydratase-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des fumarate hydratase-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem FH-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.