FucT-VIII CRISPR Activation Plasmid (h): sc-402957-ACT

FUT8 kodiert die Alpha-(1,6)-Fucosyltransferase (FucT-VIII), ein im Golgi-Apparat lokalisiertes Enzym, das die Kernfucosylierung N‑verknüpfter Glykane auf Glykoproteinen katalysiert. Diese Modifikation beeinflusst Proteinfaltung und -sekretion, Rezeptor‑Ligand‑Interaktionen sowie nachgeschaltete Signalübertragung in Signalwegen, die vom Glykosylierungsstatus abhängen, einschließlich Netzwerken von Wachstumsfaktoren und Immunrezeptoren. Eine veränderte FUT8-Aktivität steht mit Änderungen in Zelladhäsion und Migration in Verbindung und wurde mit der fehlregulierten Umgestaltung von Glykoproteinen assoziiert, wie sie in der Krebsbiologie, bei Entzündungen und bei angeborenen Störungen der Glykosylierung beobachtet wird. Daher wird FUT8 intensiv in der Glykobiologie, der Qualitätskontrolle sekretierter Proteine und in Mechanismen untersucht, die die Glykanverarbeitung im Golgi mit der Signaltransduktion koppeln.

FucT-VIII Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen FUT8-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

FucT-VIII Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des FUT8-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der FUT8-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen FucT-VIII-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native FUT8-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von FucT-VIII-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des FucT-VIII-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem FUT8-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.