frizzled-1 CRISPR Activation Plasmid (h): sc-401365-ACT

FZD1 kodiert Frizzled-1, einen WNT-Rezeptor mit sieben Transmembrandomänen, der extrazelluläre WNT-Liganden mit intrazellulären Signalkaskaden koppelt, die die Festlegung des Zellschicksals, die Polarität und die Proliferation steuern. Nach Ligandenbindung kann Frizzled-1 kanonische, β‑Catenin/TCF-abhängige Transkriptionsprogramme aktivieren und mit nicht-kanonischen Signalwegen der planaren Zellpolarität (PCP) sowie dem WNT/Ca²⁺-Signalweg interagieren, wodurch Zytoskelettdynamik und Migration beeinflusst werden. Eine fehlregulierte FZD1-Signalisierung wurde mit einer abweichenden WNT-Netzwerkaktivität in Verbindung gebracht, wie sie bei onkogener Transformation, Fibrose und Entwicklungsstörungen beobachtet wird. Als Zelloberflächenrezeptor eignet sich Frizzled-1 zudem zur Untersuchung von Ligand–Rezeptor-Selektivität, Signalweg-Crosstalk und Rezeptor-Trafficking in humanen Modellsystemen.

frizzled-1 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen FZD1-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

frizzled-1 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des FZD1-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der FZD1-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen frizzled-1-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native FZD1-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von frizzled-1-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des frizzled-1-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem FZD1-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.