Freud-1 CRISPR Activation Plasmid (h): sc-408241-ACT

Das humane CC2D1A-Gen kodiert Freud-1, ein regulatorisches Protein mit Coiled-Coil- und C2-Domänen, das als DNA-bindender Transkriptionsmodulator und als Signalisierungsgerüst (Scaffold) fungiert. Freud-1 wird mit der Kontrolle serotonerger und dopaminerger Genprogramme in Verbindung gebracht, einschließlich der Regulation von Rezeptorgenen über deren Promotoren, und ist an zellulären Prozessen wie dem Gleichgewicht zwischen Transkriptionsrepression und -aktivierung, der neuronalen Differenzierung und der synaptischen Signalübertragung beteiligt. CC2D1A greift zudem in membranassoziierte Signalwege ein, darunter Akt-assoziierte Signalgebung, was mit Rollen in Zellüberleben und Stressantworten vereinbar ist. Eine veränderte CC2D1A/Freud-1-Aktivität wurde mit neuroentwicklungsbezogenen und neuropsychiatrischen Phänotypen assoziiert und unterstreicht damit ihre Bedeutung für mechanistische Studien zur neuronalen Genregulation.

Freud-1 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen CC2D1A-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

Freud-1 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des CC2D1A-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der CC2D1A-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen Freud-1-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native CC2D1A-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von Freud-1-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des Freud-1-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem CC2D1A-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.