FOXD2 CRISPR Activation Plasmid (h): sc-410785-ACT

FOXD2 kodiert einen Transkriptionsfaktor der Forkhead-Box-(FOX)-Familie, der an sequenzspezifische DNA-Motive bindet, um Genexpressionsprogramme zu regulieren, die an zellulärer Identität und entwicklungsbiologischer Musterbildung beteiligt sind. Als nukleärer Regulator trägt FOXD2 zu Transkriptionsnetzwerken bei, die die Festlegung von Zelllinien, die Differenzierung und die Gewebemorphogenese durch koordinierte Modulation nachgeschalteter Zielgene steuern. Eine fehlregulierte Transkriptionskontrolle durch FOX-Familienmitglieder wird häufig mit aberranter Proliferation und veränderten Differenzierungszuständen in Verbindung gebracht, was FOXD2 für Studien zu Entwicklungsstörungen und krebsassoziierten genregulatorischen Schaltkreisen relevant macht. Humanes FOXD2 ist daher nützlich, um in Modellsystemen zu untersuchen, wie die Dosierung von Transkriptionsfaktoren chromatinabhängige Transkriptionsausgaben umformt.

FOXD2 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen FOXD2-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

FOXD2 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des FOXD2-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der FOXD2-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen FOXD2-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native FOXD2-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von FOXD2-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des FOXD2-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem FOXD2-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.