Plásmido CRISPR de Activación (h) Flt-4: sc-400684-ACT

FLT4 codifica la tirosina quinasa receptora humana Flt-4 (VEGFR-3), un nodo de señalización principal en las células endoteliales linfáticas que se une a VEGF-C y VEGF-D para regular la linfangiogénesis, la remodelación vascular y la supervivencia endotelial. Tras la unión del ligando, Flt-4 activa vías posteriores, entre ellas PI3K–AKT, MAPK/ERK y PLCγ–PKC, para coordinar respuestas de proliferación, migración y permeabilidad. La señalización desregulada de FLT4 se ha implicado en el desarrollo linfático anómalo y en la homeostasis de los fluidos tisulares, y se estudia con frecuencia en el contexto de la linfangiogénesis asociada a tumores y la diseminación metastásica. Como receptor de membrana con salidas de señalización dependientes del contexto, FLT4 constituye un blanco accesible para analizar la dinámica ligando–receptor, el tráfico del receptor y la comunicación cruzada entre vías en biología vascular.

Flt-4 El plásmido de activación CRISPR (h) proporciona un enfoque específico y no destructivo para regular al alza la expresión endógena de FLT4 sin alterar la secuencia de ADN subyacente.

Flt-4 El plásmido de activación CRISPR (h) es un sistema mediador de activación sinérgica (SAM) de tres plásmidos diseñado para la regulación al alza transcripcional altamente eficiente y específica del locus FLT4 en líneas celulares humanas. El sistema se basa en una Cas9 catalíticamente inactiva (dCas9) que porta dos mutaciones inactivadoras (D10A y N863A) que eliminan la actividad nucleasa al tiempo que conservan la unión al ADN. Esta dCas9 se fusiona con VP64, un potente activador transcripcional, y se coexpresa con un gen de resistencia a la blasticidina para la selección. El segundo plásmido codifica la proteína de fusión MS2-p65-HSF1, un complejo activador secundario que actúa en conjunto con dCas9-VP64, junto con un gen de resistencia a la higromicina. El tercer plásmido codifica un ARN guía (sgRNA) específico del objetivo de 20 nt fusionado a dos aptámeros de ARN MS2 que reclutan el complejo MS2-p65-HSF1 al sitio de activación, acompañado de un gen de resistencia a la puromicina. Los tres plásmidos se administran en una proporción de masa de 1:1:1 para una expresión equilibrada de todos los componentes del sistema.

Una vez ensamblado en el locus diana, el complejo SAM se une aproximadamente 200 pb aguas arriba del sitio de inicio transcripcional FLT4, donde VP64, p65 y HSF1 actúan de forma coordinada para reclutar la maquinaria transcripcional e impulsar la regulación al alza de la expresión endógena de Flt-4. A diferencia de la Cas9 con actividad nucleasa, dCas9 no introduce roturas de doble cadena ni modifica la secuencia genómica, preservando el locus nativo FLT4 y permitiendo el estudio de las respuestas transcripcionales dependientes de Flt-4 en el locus endógeno, lo que la convierte en una herramienta valiosa para estudios funcionales, la identificación de genes diana y la modelización de la restauración de la vía Flt-4 en células tumorales con expresión de FLT4 silenciada o reducida.

Sólo para uso en investigación. No destinado a uso diagnóstico o terapéutico.