Flt-3/Flk-2 CRISPR Activation Plasmid (h): sc-400218-ACT

FLT3 (Flt-3/Flk-2) kodiert eine Rezeptor-Tyrosinkinase der Klasse III, die überwiegend in hämatopoetischen Vorläuferzellen exprimiert wird; die Bindung des FLT3-Liganden fördert dort Proliferation, Überleben und Differenzierung. Die Aktivierung des Rezeptors stößt nachgeschaltete PI3K–AKT-, RAS–MAPK- und JAK–STAT-Signalwege an und integriert Signale, die die myeloide und lymphoide Entwicklung regulieren. Eine dysregulierte FLT3-Signalübertragung, einschließlich aktivierender Mutationen und aberranter Expression, wird häufig im Zusammenhang mit Leukämogenese und veränderter Festlegung hämatopoetischer Zellschicksale untersucht. Daher dient FLT3 als breit genutzter molekularer Ansatzpunkt, um Wachstumsfaktorrezeptor-Signaling, Vorläuferzellbiologie und das durch onkogene Kinasen getriebene Umverdrahten von Signalnetzwerken in humanen Zellmodellen zu untersuchen.

Flt-3/Flk-2 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen FLT3-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

Flt-3/Flk-2 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des FLT3-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der FLT3-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen Flt-3/Flk-2-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native FLT3-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von Flt-3/Flk-2-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des Flt-3/Flk-2-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem FLT3-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.