Flk-1/KDR/VEGFR2 CRISPR Activation Plasmid (h): sc-400118-ACT

KDR kodiert die Rezeptor-Tyrosinkinase VEGFR2 (Flk-1/KDR), einen zentralen Signalknoten für VEGF-gesteuerte Antworten vaskulärer Endothelzellen. Nach Ligandenbindung und Autophosphorylierung des Rezeptors aktiviert VEGFR2 PI3K–AKT-, PLCγ–PKC–MAPK/ERK-, Src/FAK- sowie eNOS-gekoppelte Signalkaskaden, die Proliferation, Migration, Überleben und Permeabilität von Endothelzellen koordinieren. Dieser Signalweg ist wesentlich für angiogene und lymphangiogene Programme und wird häufig im Zusammenhang mit Tumorneovaskularisierung, ischämieassoziiertem Remodeling und entzündlicher vaskulärer Dysfunktion untersucht. Eine dysregulierte KDR-Signalübertragung wurde mit veränderter mikrovaskulärer Integrität und aberranten Endothel-Perizyten-Interaktionen in Verbindung gebracht, die für die Biologie kardiovaskulärer und okulärer Erkrankungen relevant sind.

Flk-1/KDR/VEGFR2 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen KDR-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

Flk-1/KDR/VEGFR2 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des KDR-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der KDR-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen Flk-1/KDR/VEGFR2-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native KDR-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von Flk-1/KDR/VEGFR2-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des Flk-1/KDR/VEGFR2-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem KDR-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.