FLG/Filaggrin CRISPR Activation Plasmid (h): sc-400644-ACT

FLG kodiert Filaggrin, ein histidinreiches Protein, das während der terminalen Differenzierung von Keratinozyten gebildet wird und für die Ausbildung der epidermalen Barriere essenziell ist. Durch die Prozessierung von Profilaggrin entstehen Filaggrin-Monomere, die Keratin-Intermediärfilamente aggregieren, den Aufbau der verhornenden Hülle (cornified envelope) fördern und die Architektur des Stratum corneum unterstützen, wodurch FLG mit Keratinisierung sowie Programmen der epidermalen Differenzierung verknüpft ist. Der anschließende Abbau von Filaggrin trägt zu Komponenten des Natural Moisturizing Factor (NMF) bei, die Hydratation und den pH-Wert des Stratum corneum regulieren und dadurch Proteaseaktivität sowie angeborene Abwehrmechanismen beeinflussen. Ein Funktionsverlust oder eine verminderte FLG-Expression ist stark mit Barrierefunktionsstörungen und einer erhöhten Anfälligkeit für entzündliche Hautphänotypen assoziiert, weshalb FLG ein zentrales Ziel für die Erforschung der epithelialen Homöostase und von Stressantworten ist.

FLG/Filaggrin Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen FLG-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

FLG/Filaggrin Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des FLG-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der FLG-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen FLG/Filaggrin-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native FLG-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von FLG/Filaggrin-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des FLG/Filaggrin-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem FLG-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.