FKHR/FOXO1 Plasmide di attivazione CRISPR (m): sc-425179-ACT

Il gene murino Foxo1 codifica il fattore di trascrizione della famiglia forkhead box FKHR/FOXO1, un effettore centrale della segnalazione insulina/IGF-1–PI3K–AKT che coordina programmi trascrizionali responsabili di gluconeogenesi, risposte allo stress ossidativo, arresto del ciclo cellulare, apoptosi e omeostasi delle cellule immunitarie. La fosforilazione dipendente da AKT regola lo shuttling nucleo-citoplasma di FOXO1 e la sua attività trascrizionale, integrando lo stato nutrizionale con le vie metaboliche e di sopravvivenza. Studi in vivo e cellulari collegano un’alterata attività di Foxo1 a disfunzioni metaboliche, differenziazione aberrante dei linfociti e fenotipi di resistenza allo stress, rendendolo un nodo ampiamente utilizzato per analizzare il crosstalk tra vie di segnalazione. Foxo1 interagisce anche con la segnalazione di TGF-β, mTOR e con le vie infiammatorie, sostenendo la ricerca su reti trascrizionali che modellano lo sviluppo tissutale e stati cellulari rilevanti per la malattia.

FKHR/FOXO1 Il plasmide di attivazione CRISPR (m) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di Foxo1 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

FKHR/FOXO1 Il plasmide di attivazione CRISPR (m) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus Foxo1 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione Foxo1, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di FKHR/FOXO1. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus Foxo1 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da FKHR/FOXO1 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via FKHR/FOXO1 nelle cellule tumorali con espressione di Foxo1 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.