FKHR/FOXO1 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-400137-ACT

FOXO1 (FKHR) codifica un fattore di trascrizione della famiglia forkhead box che integra i segnali dell’insulina/IGF-1 e dei fattori di crescita per coordinare il controllo del ciclo cellulare, l’apoptosi, le risposte allo stress ossidativo e l’omeostasi metabolica. L’attività di FOXO1 è regolata da modificazioni post-traduzionali e dalla localizzazione subcellulare a valle della segnalazione PI3K–AKT, con ulteriori input da AMPK e da vie attivate dallo stress. Nel nucleo, FOXO1 regola programmi trascrizionali coinvolti nella gluconeogenesi, nell’autofagia e nella differenziazione, influenzando decisioni di destino cellulare dipendenti dal contesto. Una segnalazione di FOXO1 deregolata è implicata nella resistenza all’insulina e nelle malattie metaboliche, nell’alterazione della funzione delle cellule immunitarie e in processi oncogenici, inclusa la fusione PAX3–FOXO1 osservata nel rabdomiosarcoma alveolare.

FKHR/FOXO1 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di FOXO1 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

FKHR/FOXO1 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus FOXO1 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione FOXO1, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di FKHR/FOXO1. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus FOXO1 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da FKHR/FOXO1 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via FKHR/FOXO1 nelle cellule tumorali con espressione di FOXO1 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.