FIG4 CRISPR Activation Plasmid (m): sc-430460-ACT

Das Mausgen **Fig4** kodiert **FIG4**, eine SAC-Phosphoinositid-5-Phosphatase, die die Homöostase von **Phosphatidylinositol-3,5-bisphosphat** auf endolysosomalen Membranen steuert. Über seine Funktion im regulatorischen **PIKfyve/VAC14/FIG4**-Komplex unterstützt FIG4 die Endosomenreifung, die Lysosomenfunktion, den Membrantransport und die Autophagie, mit nachgeschalteten Effekten auf den Erhalt von Neuronen und die Myelinbiologie. Eine Störung der FIG4-abhängigen Phosphoinositid-Signalgebung beeinträchtigt die endolysosomale Dynamik und wurde in genetischen Studien mit neurodegenerativen und neuromuskulären Phänotypen in Verbindung gebracht, was **Fig4** zu einem nützlichen Lokus für die Modellierung von transportgetriebenem zellulärem Stress im Mausmodell macht.

FIG4 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (m) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen Fig4-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

FIG4 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (m) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des Fig4-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der Fig4-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen FIG4-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native Fig4-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von FIG4-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des FIG4-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem Fig4-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.