Fibronectin CRISPR Activation Plasmid (h): sc-400082-ACT

FN1 kodiert Fibronectin, ein wichtiges Glykoprotein der extrazellulären Matrix, das Zelladhäsion, Migration und Gewebeumbau durch Bindung an Integrine, Kollagen und Heparansulfat-Proteoglykane koordiniert. Fibronectin ist an Fokalkontakten und der Mechanotransduktion beteiligt, steuert die Dynamik des Aktinzytoskeletts und reguliert Signalwege wie FAK/SRC, Rho-GTPase-Signalisierung sowie die TGF-β‑getriebene Organisation der extrazellulären Matrix. In der Humanbiologie ist eine veränderte FN1-Expression oder -Ablagerung mit gestörter Wundheilung, Fibrose, Tumorzellinvasion und der Umgestaltung des stromalen Mikroumfelds assoziiert. Diese Eigenschaften machen FN1 zu einem zentralen Ziel für die Untersuchung der Assemblierung der extrazellulären Matrix, der epithelial‑mesenchymalen Plastizität und integrinabhängiger Signalnetzwerke.

Fibronectin Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen FN1-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

Fibronectin Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des FN1-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der FN1-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen Fibronectin-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native FN1-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von Fibronectin-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des Fibronectin-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem FN1-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.