Fhit CRISPR Activation Plasmid (h): sc-404220-ACT

FHIT kodiert Fhit, ein Nukleotid-bindendes Protein der Histidin-Triad-(HIT)-Familie, das häufig mit der Aufrechterhaltung der Genomintegrität und zellulären Stressantworten in Verbindung gebracht wird. Fhit ist an Signalprozessen beteiligt, die die Überwachung von DNA-Schäden, Replikationsstress und apoptotische Signalwege beeinflussen, und seine Aktivität wurde mit der Regulation von Proliferation und zellulärer Transformation verknüpft. Als Lokus innerhalb eines häufig fragilen Chromosomenbereichs (common fragile site) wird FHIT oft im Kontext genomischer Instabilität und veränderter Expressionsmuster untersucht, die in unterschiedlichen tumorabgeleiteten Modellen beobachtet werden. Diese Eigenschaften machen FHIT zu einem nützlichen Ziel, um Signalwege zu analysieren, die den Nukleotidstoffwechsel und Stresssignalgebung mit der Zellzykluskontrolle koppeln.

Fhit Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen FHIT-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

Fhit Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des FHIT-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der FHIT-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen Fhit-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native FHIT-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von Fhit-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des Fhit-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem FHIT-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.