Ferroportin-1 CRISPR Activation Plasmid (m): sc-424774-ACT

Slc40a1 kodiert Ferroportin-1, den wichtigsten zellulären Eisenexporter, der den Eisenausstrom aus Enterozyten, Makrophagen und Hepatozyten steuert, um die systemische Eisenverfügbarkeit aufrechtzuerhalten. Die Aktivität von Ferroportin-1 wird streng über die Hepcidin–Ferroportin-Achse reguliert: Die Bindung von Hepcidin löst die Internalisierung und den Abbau von Ferroportin aus und koppelt damit den Eisenexport an entzündungs- und ernährungsbedingte Signale. Über diese Prozesse beeinflusst Slc40a1 die Erythropoese, Reaktionen auf oxidativen Stress und den Umgang von Makrophagen mit Eisen und verknüpft so den Eisentransport mit Immunsignalen und der metabolischen Homöostase. Ein dysregulierter, Ferroportin-vermittelter Export wird häufig in Modellen der Eisenüberladung, der Entzündungsanämie und von Wirt–Pathogen-Interaktionen untersucht, bei denen Eisenrestriktion die mikrobielle Fitness und Gewebeschädigung mitbestimmt.

Ferroportin-1 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (m) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen Slc40a1-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

Ferroportin-1 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (m) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des Slc40a1-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der Slc40a1-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen Ferroportin-1-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native Slc40a1-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von Ferroportin-1-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des Ferroportin-1-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem Slc40a1-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.