FANCI CRISPR Activation Plasmid (h): sc-402229-ACT

FANCI kodiert eine Schlüsselkomponente des Fanconi-Anämie-(FA)-DNA-Reparaturwegs, der bei Replikationsstress die Integrität des Genoms schützt. Nach DNA-Schäden durch interstrangige Quervernetzungen bildet FANCI mit FANCD2 den ID‑Komplex, wird regulatorisch phosphoryliert und monoubiquitinyliert und koordiniert die nukleolytische Prozessierung mit homologer Rekombination, um den Neustart blockierter Replikationsgabeln zu ermöglichen. Diese Signalkaskade ist mit der ATR‑abhängigen Checkpoint-Kontrolle und der replikationsgekoppelten Reparatur verknüpft, um Chromosomenbrüche und die Bildung von Mikrokernen zu begrenzen. Störungen in der Regulation des FA‑Signalwegs, einschließlich einer FANCI‑Dysfunktion, sind mit erblichen Genominstabilitäts-Syndromen assoziiert und werden aufgrund ihrer Auswirkungen auf DNA-Schadensensitivität und Mutationslast intensiv untersucht.

FANCI Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen FANCI-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

FANCI Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des FANCI-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der FANCI-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen FANCI-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native FANCI-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von FANCI-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des FANCI-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem FANCI-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.