Plásmido CRISPR de Activación (h) FANCD2: sc-400445-ACT

FANCD2 codifica un efector central de la vía de reparación de enlaces cruzados interhebra (ICL) del ADN de la anemia de Fanconi (FA), que protege la estabilidad del genoma durante la replicación del ADN. Tras el estrés replicativo o el daño por enlaces cruzados, FANCD2 se monoubiquitina y coopera con FANCI para coordinar el procesamiento nucleolítico, la síntesis de translesión y la recombinación homóloga, conectando el complejo central de FA con redes de reparación asociadas a BRCA. Esta actividad está estrechamente acoplada a la señalización del punto de control de la fase S y a la protección de la horquilla de replicación, lo que ayuda a limitar la rotura cromosómica y la recombinación aberrante. La desregulación o los defectos hereditarios en la función de FANCD2 se asocian con la biología de la anemia de Fanconi y con mecanismos más amplios de sensibilidad al daño del ADN y de fallo de las vías supresoras de tumores en contextos de investigación.

FANCD2 El plásmido de activación CRISPR (h) proporciona un enfoque específico y no destructivo para regular al alza la expresión endógena de FANCD2 sin alterar la secuencia de ADN subyacente.

FANCD2 El plásmido de activación CRISPR (h) es un sistema mediador de activación sinérgica (SAM) de tres plásmidos diseñado para la regulación al alza transcripcional altamente eficiente y específica del locus FANCD2 en líneas celulares humanas. El sistema se basa en una Cas9 catalíticamente inactiva (dCas9) que porta dos mutaciones inactivadoras (D10A y N863A) que eliminan la actividad nucleasa al tiempo que conservan la unión al ADN. Esta dCas9 se fusiona con VP64, un potente activador transcripcional, y se coexpresa con un gen de resistencia a la blasticidina para la selección. El segundo plásmido codifica la proteína de fusión MS2-p65-HSF1, un complejo activador secundario que actúa en conjunto con dCas9-VP64, junto con un gen de resistencia a la higromicina. El tercer plásmido codifica un ARN guía (sgRNA) específico del objetivo de 20 nt fusionado a dos aptámeros de ARN MS2 que reclutan el complejo MS2-p65-HSF1 al sitio de activación, acompañado de un gen de resistencia a la puromicina. Los tres plásmidos se administran en una proporción de masa de 1:1:1 para una expresión equilibrada de todos los componentes del sistema.

Una vez ensamblado en el locus diana, el complejo SAM se une aproximadamente 200 pb aguas arriba del sitio de inicio transcripcional FANCD2, donde VP64, p65 y HSF1 actúan de forma coordinada para reclutar la maquinaria transcripcional e impulsar la regulación al alza de la expresión endógena de FANCD2. A diferencia de la Cas9 con actividad nucleasa, dCas9 no introduce roturas de doble cadena ni modifica la secuencia genómica, preservando el locus nativo FANCD2 y permitiendo el estudio de las respuestas transcripcionales dependientes de FANCD2 en el locus endógeno, lo que la convierte en una herramienta valiosa para estudios funcionales, la identificación de genes diana y la modelización de la restauración de la vía FANCD2 en células tumorales con expresión de FANCD2 silenciada o reducida.

Sólo para uso en investigación. No destinado a uso diagnóstico o terapéutico.