Plasmide CRISPR d'Activation (h) FADD: sc-400580-ACT

Le FADD humain (Fas-associated protein with death domain) est une molécule adaptatrice qui transmet les signaux issus des récepteurs de mort, notamment FAS et les membres de la famille TNFRSF, afin d’initier l’apoptose extrinsèque. En reliant les complexes récepteurs aux caspases initiatrices telles que CASP8 par des interactions homotypiques de domaines de mort, FADD régule l’activation de la cascade des caspases, la mort cellulaire programmée et l’homéostasie immunitaire. Au-delà de l’apoptose, FADD influence, de manière dépendante du contexte, la signalisation NF-κB, les réponses inflammatoires et le contrôle du cycle cellulaire. Une signalisation FADD dérégulée a été impliquée dans l’altération de la compétence apoptotique et la dérégulation immunitaire observées dans divers modèles de cancers et de maladies inflammatoires.

FADD Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de FADD sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

FADD Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus FADD dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription FADD, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de FADD. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus FADD natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de FADD au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie FADD dans les cellules tumorales présentant une expression de FADD silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.