Factor H CRISPR Activation Plasmid (h): sc-401099-ACT

Komplementfaktor H (CFH) kodiert Faktor H, einen löslichen Regulator des alternativen Komplementwegs, der Wirtsoberflächen schützt, indem er den Abbau (Decay) der C3-Konvertase beschleunigt und als Kofaktor für die durch Faktor I vermittelte Inaktivierung von C3b dient. Indem Faktor H über Interaktionen mit Glykosaminoglykanen und Sialinsäuren zwischen „selbst“ und „nicht-selbst“ unterscheidet, trägt er dazu bei, Komplementamplifikation, Opsonisierung und nachgeschaltete inflammatorische Signalübertragung zu begrenzen. Störungen der CFH-Expression oder -Funktion stehen in Zusammenhang mit fehlregulierter Komplementaktivität, die an der altersbedingten Makuladegeneration, dem atypischen hämolytisch-urämischen Syndrom und glomerulären entzündlichen Phänotypen beteiligt ist. CFH wird daher breit in der Forschung zur angeborenen Immunität, zur Gefäß- und Nierenbiologie sowie in Modellen komplementgetriebener Gewebeschädigung untersucht.

Factor H Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen CFH-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

Factor H Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des CFH-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der CFH-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen Factor H-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native CFH-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von Factor H-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des Factor H-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem CFH-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.