EYA4 CRISPR Activation Plasmid (h): sc-404355-ACT

EYA4 kodiert ein Mitglied der Eyes-Absent-(EYA)-Familie, das als transkriptioneller Koaktivator und als Phosphatase wirkt und entwicklungsbezogene Transkriptionsprogramme mit einer signalabhängigen Regulation des Zellschicksals verknüpft. EYA4 ist an genregulatorischen Netzwerken beteiligt, die Differenzierung, Organogenese und die Aufrechterhaltung sensorischer Systeme beeinflussen, und kann an Signalwege gekoppelt sein, die den nukleären Transkriptionsoutput sowie stressresponsive Signalübertragung steuern. In der Humanbiologie wurden eine veränderte Aktivität oder Expression von EYA4 mit Phänotypen in Zusammenhang gebracht, die das Hörvermögen und Kardiomyopathien betreffen, was EYA4 zu einem relevanten Ziel für die Untersuchung von Mechanismen der Gewebehomöostase und -dysfunktion macht. Forschende untersuchen EYA4 häufig, um zu verstehen, wie transkriptionelle Kofaktoren und Phosphataseaktivitäten die linien-/zelltypspezifische Genexpression und die zelluläre Anpassung koordinieren.

EYA4 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen EYA4-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

EYA4 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des EYA4-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der EYA4-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen EYA4-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native EYA4-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von EYA4-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des EYA4-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem EYA4-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.