EXOSC8 CRISPR Activation Plasmid (h): sc-405322-ACT

EXOSC8 kodiert eine zentrale Untereinheit des menschlichen RNA-Exosom-Komplexes, einer multiproteinären 3′–5′-Exoribonuklease, die die RNA-Qualitätskontrolle und den RNA-Umsatz im Zellkern und im Zytoplasma steuert. Durch die koordinierte Prozessierung und den Abbau von rRNA, snRNA, snoRNA sowie mRNA-Abbauintermediaten trägt EXOSC8 zu RNA-Überwachungswegen bei, die die Integrität des Transkriptoms und die Proteostase aufrechterhalten. Eine Störung der Exosom-Funktion beeinträchtigt die Ribosomenbiogenese, die transkriptionelle Homöostase und Stressantworten und verknüpft eine Fehlregulation von EXOSC8 mit neuroentwicklungsbedingten und neurodegenerativen Phänotypen, wie sie für Exosom-assoziierte Gene beschrieben wurden. Daher ist EXOSC8 ein nützliches Ziel für die Untersuchung des RNA-Metabolismus, der ko-transkriptionellen Prozessierung und der Mechanismen des RNA-Abbaus in menschlichen Zellen.

EXOSC8 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen EXOSC8-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

EXOSC8 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des EXOSC8-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der EXOSC8-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen EXOSC8-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native EXOSC8-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von EXOSC8-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des EXOSC8-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem EXOSC8-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.