Exo1 CRISPR Activation Plasmid (h): sc-402356-ACT

Human EXO1 kodiert Exo1, eine 5′→3′-Exonuklease, die bei der Endresektion von DNA und der Verarbeitung von Rekombinationsintermediaten während der homologen Rekombination sowie der Reparatur von DNA-Doppelstrangbrüchen wirkt. Exo1 ist außerdem an der DNA-Mismatch-Reparatur beteiligt, indem es mit MutS/MutL-Komplexen zusammenarbeitet, um fehlgepaarte Nukleotide auszuschneiden, und so zur Aufrechterhaltung der Genomintegrität während der Replikation beiträgt. Über seine Funktionen bei der Stabilisierung von Replikationsgabeln, der Checkpoint-Signalgebung und der Wahl von Reparaturwegen beeinflusst EXO1 zelluläre Antworten auf genotoxischen Stress und die chromosomale Stabilität. Eine Fehlregulation der EXO1-Expression oder -Aktivität wurde mit einer erhöhten Mutationslast und Phänotypen genomischer Instabilität in Verbindung gebracht, die häufig in der Krebsbiologie und im Kontext erblicher DNA-Reparaturdefekte untersucht werden.

Exo1 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen EXO1-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

Exo1 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des EXO1-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der EXO1-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen Exo1-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native EXO1-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von Exo1-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des Exo1-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem EXO1-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.