ETEA Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-403730-ACT

FAF2 codifica a proteína ETEA, residente no retículo endoplasmático (também conhecida como UBXD8), um adaptador com domínio UBX que conecta substratos ubiquitinados à ATPase p97/VCP, apoiando a degradação associada ao retículo endoplasmático (ERAD) e a proteostase. Ao coordenar a extração e a eliminação de proteínas do RE mal dobradas ou reguladas, a ETEA contribui para o acoplamento à resposta a proteínas mal dobradas, para a organização de gotículas lipídicas e para a homeostase metabólica. A atividade de FAF2/ETEA cruza-se com vias de ubiquitina–proteassoma e com a dinâmica de contato entre RE e gotículas lipídicas, que influenciam a resiliência celular ao estresse. Alterações na regulação de ERAD e do metabolismo lipídico têm sido associadas a estados de estresse proteotóxico e disfunção metabólica, tornando o FAF2 um nó útil para estudos mecanísticos nesses contextos.

ETEA O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de FAF2 sem alterar a sequência de ADN subjacente.

ETEA O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus FAF2 em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição FAF2, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de ETEA. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus FAF2 nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de ETEA no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via ETEA em células tumorais com expressão de FAF2 silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.