ESET CRISPR Activation Plasmid (h): sc-401325-ACT

Humanes SETDB1 kodiert ESET, eine Histon-Lysin-Methyltransferase mit SET-Domäne, die repressive H3K9me3-Markierungen setzt und so die Bildung von Heterochromatin sowie eine stabile Genstilllegung fördert. ESET wirkt an der epigenetischen Regulation der Transkription, der Unterdrückung endogener Retroelemente und der Aufrechterhaltung der Genomintegrität mit, unter anderem durch Interaktionen mit Korepressoren und Chromatin-Remodeling-Komplexen. Durch die Prägung linien-/zelltypspezifischer Transkriptionsprogramme beeinflusst SETDB1 Pluripotenz, Differenzierung und zellzyklusassoziierte Chromatinzustände. Eine dysregulierte SETDB1-Aktivität und veränderte H3K9-Methylierungslandschaften werden häufig im Kontext onkogener transkriptioneller Reprogrammierung und von Immunflucht-Phänotypen untersucht, ebenso wie im Zusammenhang mit einer allgemeineren Epigenom-Instabilität in Modellen menschlicher Erkrankungen.

ESET Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen SETDB1-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

ESET Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des SETDB1-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der SETDB1-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen ESET-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native SETDB1-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von ESET-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des ESET-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem SETDB1-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.