ERK 1 CRISPR Activation Plasmid (h): sc-400010-ACT

MAPK3 kodiert die extrazellulär signalregulierte Kinase 1 (ERK1), eine Serin/Threonin-Kinase, die als zentraler Effektor der RAS–RAF–MEK–ERK-MAPK-Kaskade fungiert. ERK1 leitet Signale von Wachstumsfaktoren, Zytokinen und Stressreizen weiter, um Transkriptionsprogramme zu regulieren, die Proliferation, Differenzierung, Stoffwechsel und Zellüberleben steuern, und zwar durch Phosphorylierung nukleärer und zytoplasmatischer Substrate. Dieser Signalweg koordiniert den Fortschritt des Zellzyklus, die Expression von Immediate-Early-Genen sowie die Rückkopplungsregulation vorgeschalteter Rezeptoren und Kinasen. Eine fehlregulierte ERK-Signalübertragung ist häufig an onkogenen Signalnetzwerken sowie an inflammatorischen oder neurobiologischen Phänotypen beteiligt, wodurch MAPK3 ein häufiger Knotenpunkt für mechanistische Untersuchungen zur Umverdrahtung des Signalwegs und zu kontextabhängigen Signalausgängen ist.

ERK 1 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen MAPK3-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

ERK 1 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des MAPK3-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der MAPK3-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen ERK 1-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native MAPK3-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von ERK 1-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des ERK 1-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem MAPK3-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.