EPHX2 CRISPR Activation Plasmid (h): sc-402095-ACT

EPHX2 kodiert die lösliche Epoxidhydrolase (sEH), ein bifunktionales Enzym, das bioaktive Epoxy-Fettsäuren wie Epoxyeicosatriensäuren (EETs) in weniger aktive Diole umwandelt und damit den „Tonus“ von Lipidmediatoren in vaskulären, renalen und immunologischen Kontexten mitprägt. Über diese Rolle im Arachidonsäure- und im weiteren Oxylipin-Stoffwechsel beeinflusst EPHX2 Signalnetzwerke, die mit der Auflösung von Entzündungen, Endothelfunktion, oxidativen Stressantworten und der Blutdruckregulation verknüpft sind. Veränderte sEH-Aktivität und Muster der EPHX2-Expression wurden mit kardiometabolischen Merkmalen, hypertonieassoziierten Signalwegen und Mechanismen entzündlicher Erkrankungen in Verbindung gebracht, was mechanistische Studien zum Umsatz von Lipid-Epoxiden motiviert. In Zellmodellen wird die Modulation von EPHX2 genutzt, um die Wechselwirkung zwischen Lipidsignalgebung, Zytokinprogrammen und stressaktivierten transkriptionellen Antworten zu untersuchen.

sEH Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen EPHX2-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

sEH Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des EPHX2-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der EPHX2-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen sEH-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native EPHX2-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von sEH-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des sEH-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem EPHX2-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.