ephrin-A3 CRISPR Activation Plasmid (h): sc-402771-ACT

EFNA3 kodiert Ephrin-A3, einen über Glycosylphosphatidylinositol (GPI) membranverankerten Liganden für die Rezeptor-Tyrosinkinasen der EphA-Familie, der eine kontaktabhängige Zell-Zell-Kommunikation vermittelt. Das Ephrin-A3/EphA-Signaling reguliert den Umbau des Zytoskeletts, Zelladhäsion und gerichtete Migration und beeinflusst darüber die Ausbildung von Gewebegrenzen, die Axonführung und die Gefäßmusterung, unter anderem über Signalwege mit Rho-Familien-GTPasen sowie MAPK-abhängigen Programmen. In Säugersystemen wurde eine veränderte Ephrin–Eph-Signalgebung mit Änderungen der neuronalen Konnektivität, angiogenem Remodeling und invasiven Phänotypen in verschiedenen Krankheitskontexten in Verbindung gebracht, was EFNA3 zu einem nützlichen Knotenpunkt für die Untersuchung von Signalgebung im Mikromilieu macht. Die Aktivität von humanem EFNA3 ist daher relevant, um zu verstehen, wie membrangebundenen Signale Differenzierung, Motilität und Gewebeorganisation steuern.

ephrin-A3 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen EFNA3-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

ephrin-A3 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des EFNA3-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der EFNA3-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen ephrin-A3-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native EFNA3-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von ephrin-A3-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des ephrin-A3-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem EFNA3-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.