ephrin-A2 CRISPR Activation Plasmid (h): sc-403672-ACT

EFNA2 kodiert Ephrin-A2, einen über Glycosylphosphatidylinositol (GPI) verankerten Membranliganden für Eph-Rezeptor-Tyrosinkinasen, der kontaktabhängige Signale in der Zell-Zell-Kommunikation vermittelt. Die Eph/Ephrin-Signalübertragung reguliert die Axonführung, den Aufbau neuronaler Schaltkreise, die Gefäßmusterbildung, die Ausbildung epithelialer Grenzen sowie die Zellmigration über Signalwege, die mit Rho-Familien-GTPasen, MAPK-Signalen und der Umgestaltung des Zytoskeletts verknüpft sind. Eine veränderte EFNA2-Expression oder ein gestörtes Gleichgewicht der EphA–Ephrin-A-Signalgebung wurde mit fehlregulierten Adhäsions- und Motilitätsphänotypen in Verbindung gebracht, die für neuroentwicklungsbiologische Prozesse und die Krebsbiologie relevant sind, darunter Tumorinvasion und angiogenes Remodelling. Als an der Zelloberfläche verankertes Signal eignet sich Ephrin-A2 zudem zur Untersuchung bidirektionaler Signalgebung, bei der ligand- und rezeptorexprimierende Zellen unterschiedliche nachgeschaltete Antworten auslösen.

ephrin-A2 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen EFNA2-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

ephrin-A2 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des EFNA2-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der EFNA2-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen ephrin-A2-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native EFNA2-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von ephrin-A2-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des ephrin-A2-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem EFNA2-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.