EphB6 CRISPR Activation Plasmid (m): sc-420202-ACT

Mouse Ephb6 kodiert EphB6, ein kinasedefektes Mitglied der Eph-Rezeptor-Tyrosinkinase-Familie, das ephrinvermittelte Zell-Zell-Signale moduliert. EphB6 ist an Signalwegen beteiligt, die kontaktabhängige Adhäsion, Zytoskelett-Remodelling und gerichtete Zellmigration steuern, und kann über Rezeptor-Clusterbildung und Co-Rezeptor-Interaktionen nachgeschaltete Signalwege der Rho-Familie von GTPasen sowie MAPK-Signale beeinflussen. In sich entwickelnden und adulten Geweben trägt EphB6 zur Ausbildung von Gewebegrenzen und zur Kommunikation von Immunzellen bei – Prozesse, die häufig mit veränderter Gewebeorganisation und fehlregulierten Entzündungsreaktionen in Verbindung stehen. Veränderungen der Eph/Ephrin-Signalgebung sind allgemein mit aberranter Motilität und veränderten Interaktionen mit dem Mikromilieu assoziiert, wodurch die Regulation von EphB6 für mechanistische Studien in Modellen der Entwicklung, Neurobiologie und Krebsbiologie relevant ist.

EphB6 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (m) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen Ephb6-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

EphB6 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (m) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des Ephb6-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der Ephb6-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen EphB6-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native Ephb6-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von EphB6-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des EphB6-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem Ephb6-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.