eotaxin CRISPR Activation Plasmid (h): sc-403103-ACT

CCL11 kodiert Eotaxin (CCL11), ein sezerniertes CC‑Chemokin, das an CCR3 bindet und die Chemotaxis von Eosinophilen sowie anderen CCR3‑exprimierenden Leukozyten zu Entzündungsherden steuert. Die Eotaxin‑Signalgebung koordiniert das Trafficking, die Adhäsion und Aktivierung von Leukozyten in mukosalen und vaskulären Kompartimenten und prägt dadurch Typ‑2‑Immunantworten sowie Programme des Gewebeumbaus. Eine dysregulierte CCL11‑Expression wurde mit allergischen Entzündungen und Asthma in Verbindung gebracht, ebenso mit breiteren entzündlichen Mikroumgebungen, in denen die Rekrutierung von Eosinophilen und Zytokin‑Crosstalk die Pathologie beeinflussen. In humanen Zellmodellen liefert die Modulation von CCL11 einen gut handhabbaren Readout zur Untersuchung von Chemokin‑Netzwerken, Signalen für die Leukozytenmigration und der zytokingetriebenen transkriptionellen Regulation.

eotaxin Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen CCL11-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

eotaxin Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des CCL11-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der CCL11-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen eotaxin-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native CCL11-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von eotaxin-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des eotaxin-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem CCL11-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.