ENT2 CRISPR Activation Plasmid (h): sc-401952-ACT

Das humane Gen **SLC29A2** kodiert den equilibrativen Nukleosidtransporter 2 (**ENT2**), einen bidirektionalen Plasmamembran-Transporter, der den **Na⁺-unabhängigen** Transport von Purin- und Pyrimidin-Nukleosiden über Zellmembranen erleichtert. ENT2 trägt zur Regulation des Nukleosid-„Salvage“-Stoffwechsels, der intrazellulären Nukleotidpools und des Umgangs mit extrazellulärem Adenosin bei und verknüpft damit Membrantransport mit DNA-/RNA-Synthese, Energiestoffwechsel und purinerger Signalübertragung. Indem ENT2 die Substratverfügbarkeit für die Nukleotidbiosynthese sowie die Aufnahme bzw. den Efflux von Wirkstoffen beeinflusst, ist es für Untersuchungen zur Kontrolle der Proliferation, zu Reaktionen auf metabolischen Stress und zur Empfindlichkeit gegenüber Nukleosidanaloga in Modellsystemen relevant. Veränderungen des Nukleosidtransports und der Purin-Homöostase wurden zudem in pathophysiologischen Kontexten wie Entzündung, ischämieassoziierter Signalgebung und Tumorbiologie beschrieben, was den Einsatz ENT2-fokussierter Werkzeuge zur Analyse transportgetriebener Phänotypen unterstützt.

ENT2 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen SLC29A2-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

ENT2 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des SLC29A2-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der SLC29A2-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen ENT2-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native SLC29A2-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von ENT2-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des ENT2-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem SLC29A2-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.