ENOPH1 CRISPR Activation Plasmid (m): sc-426793-ACT

Das murine Gen **Enoph1** kodiert **ENOPH1** (Enolase-Phosphatase 1), ein bifunktionelles Metalloenzym im Methionin-„Salvage“-Weg, das zentrale Schritte bei der Umwandlung von Methylthioribulose-1-phosphat in Richtung Methionin-Remethylierung katalysiert. Durch die Unterstützung des Methionin- und Polyaminstoffwechsels verknüpft ENOPH1 die Homöostase schwefelhaltiger Aminosäuren mit der zellulären Methylierungskapazität, dem Redox-Gleichgewicht und proliferationsassoziierten metabolischen Anforderungen. Eine veränderte Aktivität des Methionin-„Salvage“-Stoffwechsels wurde mit metabolischer Reprogrammierung in Krebs sowie mit weiter gefassten Phänotypen in Verbindung gebracht, die durch Nährstoffverfügbarkeit und oxidativen Stress beeinflusst werden. ENOPH1 ist daher ein nützlicher Knotenpunkt, um in Mausmodellen die Regulation metabolischer Signalwege und deren nachgeschaltete Effekte auf Zellwachstum sowie stressresponsive Programme zu untersuchen.

ENOPH1 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (m) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen Enoph1-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

ENOPH1 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (m) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des Enoph1-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der Enoph1-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen ENOPH1-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native Enoph1-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von ENOPH1-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des ENOPH1-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem Enoph1-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.