endobrevin CRISPR Activation Plasmid (h): sc-403438-ACT

Das humane Gen **VAMP8** kodiert **Endobrevin**, ein vesikelassoziiertes SNARE-Protein, das Membranfusionsereignisse vermittelt, die für den endosomalen Transport, die regulierte Exozytose und die Granulasekretion erforderlich sind. Endobrevin ist an der Assemblierung von SNARE-Komplexen mit Partnern an der Plasmamembran beteiligt und steuert dadurch Vesikel-Andocken und -Fusion in Immunzellen, Thrombozyten und epithelialen Kompartimenten; es beeinflusst damit Prozesse wie Degranulation, Zytokinfreisetzung und Muzinsekretion. Über diese Funktionen wirkt VAMP8 auf vesikuläre Transportwege ein, die inflammatorische Signalgebung, Hämostase und Wirtsabwehr prägen. Eine fehlregulierte VAMP8-abhängige Trafficking-Aktivität wurde in der Literatur mit veränderter Sekretionsfunktion und inflammatorischen Phänotypen in Verbindung gebracht, was die Relevanz von VAMP8 für mechanistische Studien zur Vesikelfusion und zur Biologie sekretionsassoziierter Erkrankungen unterstreicht.

endobrevin Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen VAMP8-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

endobrevin Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des VAMP8-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der VAMP8-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen endobrevin-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native VAMP8-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von endobrevin-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des endobrevin-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem VAMP8-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.