ENA-78 CRISPR Activation Plasmid (h): sc-405834-ACT

CXCL5 kodiert das von Epithelzellen gebildete neutrophilenaktivierende Peptid 78 (ENA-78), ein CXC-Chemokin, das vor allem über CXCR2 signalisiert und dadurch Chemotaxis, Adhäsion und Aktivierung von Neutrophilen fördert. ENA-78 trägt zu entzündlichen Signalkaskaden bei, die sich mit NF-κB- und MAPK-regulierten Transkriptionsprogrammen überschneiden und so die Rekrutierung von Leukozyten sowie das Gewebe-Remodeling prägen. Eine dysregulierte CXCL5-Expression wurde mit chronisch entzündlichen Mikromilieus und einer veränderten stromal–immunologischen Wechselwirkung in Erkrankungen in Verbindung gebracht, in denen Neutrophileninfiltration und angiogene Signale eine wichtige Rolle spielen. Als sezernierter Mediator wird ENA-78 außerdem als Readout für die Dynamik von Zytokinnetzwerken und parakrine Signalgebung in Modellen mit epithelialen, endothelialen und myeloiden Zellen verwendet.

ENA-78 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen CXCL5-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

ENA-78 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des CXCL5-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der CXCL5-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen ENA-78-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native CXCL5-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von ENA-78-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des ENA-78-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem CXCL5-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.