Emt CRISPR Activation Plasmid (h): sc-402628-ACT

Humanes ITK kodiert die IL-2–induzierbare T‑Zell‑Kinase, eine nichtrezeptorische Tyrosinkinase der Tec‑Familie, die die Aktivierung des T‑Zell‑Rezeptors mit nachgeschalteten Signalwegen koppelt, die für die Aktivierung und Differenzierung von Lymphozyten erforderlich sind. ITK ist an proximalen TCR‑Signalwegen beteiligt, die auf die Aktivierung von PLCγ1, Calciumfluss, MAPK‑Signalgebung sowie transkriptionelle Programme zur Steuerung der Zytokinproduktion und Effektor­funktion zusammenlaufen. Eine dysregulierte ITK‑Aktivität wird mit einem veränderten Th1/Th2‑Gleichgewicht, beeinträchtigter antiviraler Immunität und abnormaler Lymphoproliferation in Verbindung gebracht und ist damit relevant für Studien zur Immunhomöostase und zu Mechanismen entzündlicher Erkrankungen. Im Kontext des Emt‑Proteins stellt ITK einen gut untersuchbaren Knotenpunkt dar, um die Dynamik der Signaltransduktion in humanen T‑Zellen und verwandten hämatopoetischen Zelllinien zu analysieren.

Emt Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen ITK-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

Emt Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des ITK-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der ITK-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen Emt-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native ITK-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von Emt-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des Emt-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem ITK-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.