Plásmido CRISPR de Activación (h) emerin: sc-401048-ACT

El gen EMD humano codifica la emerin, una proteína de la membrana nuclear interna con dominio LEM que ancla la lámina nuclear y acopla el núcleo a las fuerzas del citoesqueleto mediante interacciones con las láminas, BAF y componentes asociados al complejo LINC. La emerin contribuye a la organización de la envoltura nuclear, la mecanotransducción y el anclaje de la cromatina, e influye en la regulación transcripcional, las respuestas al daño del ADN y la progresión del ciclo celular. La alteración de la arquitectura nuclear dependiente de emerin se asocia con patología específica de tejidos en el músculo estriado y en los sistemas de conducción cardíaca, lo que convierte a EMD en un modelo ampliamente utilizado para el estudio de la biología de enfermedades asociadas a la envoltura nuclear. Como andamiaje en la periferia nuclear, la emerin se estudia con frecuencia en vías que gobiernan la rigidez nuclear, la estabilidad del genoma y programas de expresión génica dependientes de la diferenciación.

emerin El plásmido de activación CRISPR (h) proporciona un enfoque específico y no destructivo para regular al alza la expresión endógena de EMD sin alterar la secuencia de ADN subyacente.

emerin El plásmido de activación CRISPR (h) es un sistema mediador de activación sinérgica (SAM) de tres plásmidos diseñado para la regulación al alza transcripcional altamente eficiente y específica del locus EMD en líneas celulares humanas. El sistema se basa en una Cas9 catalíticamente inactiva (dCas9) que porta dos mutaciones inactivadoras (D10A y N863A) que eliminan la actividad nucleasa al tiempo que conservan la unión al ADN. Esta dCas9 se fusiona con VP64, un potente activador transcripcional, y se coexpresa con un gen de resistencia a la blasticidina para la selección. El segundo plásmido codifica la proteína de fusión MS2-p65-HSF1, un complejo activador secundario que actúa en conjunto con dCas9-VP64, junto con un gen de resistencia a la higromicina. El tercer plásmido codifica un ARN guía (sgRNA) específico del objetivo de 20 nt fusionado a dos aptámeros de ARN MS2 que reclutan el complejo MS2-p65-HSF1 al sitio de activación, acompañado de un gen de resistencia a la puromicina. Los tres plásmidos se administran en una proporción de masa de 1:1:1 para una expresión equilibrada de todos los componentes del sistema.

Una vez ensamblado en el locus diana, el complejo SAM se une aproximadamente 200 pb aguas arriba del sitio de inicio transcripcional EMD, donde VP64, p65 y HSF1 actúan de forma coordinada para reclutar la maquinaria transcripcional e impulsar la regulación al alza de la expresión endógena de emerin. A diferencia de la Cas9 con actividad nucleasa, dCas9 no introduce roturas de doble cadena ni modifica la secuencia genómica, preservando el locus nativo EMD y permitiendo el estudio de las respuestas transcripcionales dependientes de emerin en el locus endógeno, lo que la convierte en una herramienta valiosa para estudios funcionales, la identificación de genes diana y la modelización de la restauración de la vía emerin en células tumorales con expresión de EMD silenciada o reducida.

Sólo para uso en investigación. No destinado a uso diagnóstico o terapéutico.