Plasmide CRISPR d'Activation (h) eIF4AI: sc-402623-ACT

EIF4A1 code l’hélicase ARN humaine eIF4AI de la famille DEAD-box, un composant central de la machinerie d’initiation de la traduction eIF4F, qui déroule les structures des régions 5′ UTR afin de faciliter le balayage du complexe de pré‑initiation 43S et la reconnaissance du codon de départ. En régulant l’efficacité de la traduction dépendante de la coiffe, eIF4AI influence la production du protéome, la progression du cycle cellulaire et les programmes d’adaptation au stress, et elle s’articule fonctionnellement avec la signalisation mTOR et les réponses intégrées au stress qui remodèlent la traduction des ARNm. Un contrôle altéré de la traduction dépendante d’eIF4A a été associé à une dérégulation des voies de croissance et de survie observée dans de multiples contextes pathologiques, faisant d’EIF4A1 une cible fréquemment utilisée pour étudier les mécanismes de contrôle traductionnel.

eIF4AI Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de EIF4A1 sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

eIF4AI Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus EIF4A1 dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription EIF4A1, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de eIF4AI. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus EIF4A1 natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de eIF4AI au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie eIF4AI dans les cellules tumorales présentant une expression de EIF4A1 silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.