eIF2C1 CRISPR Activation Plasmid (m): sc-437349-ACT

Das murine Ago1 kodiert eIF2C1, ein Protein der Argonaute-Familie, das kleine RNAs bindet und als zentraler Effektor der RNA-Interferenz dient. eIF2C1 ist an der miRNA- und siRNA-gesteuerten posttranskriptionellen Genstilllegung beteiligt, beeinflusst die Stabilität und Translation von mRNA und prägt Genexpressionsprogramme, die mit Differenzierung, Proliferation und Stressantworten verknüpft sind. Über Interaktionen innerhalb des RISC-Komplexes und verwandter Small-RNA-Signalwege trägt Ago1 in verschiedenen Geweben zur epigenetischen und transkriptionellen Regulation bei. Eine Fehlregulation Argonaute-abhängiger Small-RNA-Netzwerke wurde mit veränderter Immun-Signalgebung, neuroentwicklungsbezogenen Phänotypen und onkogenen transkriptionellen Zuständen in Verbindung gebracht, wodurch Ago1 ein relevanter Knotenpunkt für mechanistische Studien zur Genregulationsschaltkreisen ist.

eIF2C1 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (m) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen Ago1-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

eIF2C1 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (m) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des Ago1-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der Ago1-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen eIF2C1-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native Ago1-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von eIF2C1-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des eIF2C1-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem Ago1-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.