eIF2C CRISPR Activation Plasmid (h): sc-409888-ACT

Humanes AGO1 (eIF2C1) kodiert ein Protein der Argonaute-Familie, das eine zentrale Komponente des RNA-induzierten Silencing-Komplexes (RISC) ist und kleine RNAs wie miRNAs und siRNAs mit der sequenzspezifischen Repression von Zieltranskripten koppelt. Über die durch kleine RNAs gesteuerte Bindung ist eIF2C an der posttranskriptionellen Genregulation beteiligt, beeinflusst mRNA-Stabilität und Translation und prägt Programme, die mit Differenzierung, Stressantworten und der Aufrechterhaltung genomischer Regulationsnetzwerke verknüpft sind. AGO1-abhängiges RNA-Silencing greift in umfassendere epigenetische und transkriptionelle Kontrollmechanismen ein, indem es zentrale Signal- und Rückkopplungsknoten moduliert, die die Zellidentität steuern. Eine fehlregulierte Aktivität des Argonaute/miRNA-Signalwegs wird mit veränderten Genexpressionslandschaften in verschiedenen Krebsarten sowie bei neurologischen und entzündlichen Erkrankungen in Verbindung gebracht, wodurch AGO1 ein nützlicher Ansatzpunkt zur Untersuchung RNA-regulatorischer Mechanismen ist.

eIF2C Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen AGO1-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

eIF2C Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des AGO1-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der AGO1-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen eIF2C-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native AGO1-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von eIF2C-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des eIF2C-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem AGO1-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.