eIF2C CRISPR Activation Plasmid (h): sc-400813-ACT

Das humane AGO2 (eIF2C2) kodiert Argonaute-2, den katalytischen Kern des RNA-induzierten Silencing-Komplexes (RISC), der kleine RNAs bindet, um eine sequenzspezifische Repression von Zieltranskripten zu steuern. AGO2 vermittelt eine posttranskriptionelle Genregulation durch miRNA- und siRNA-geleitete mRNA-Spaltung, Translationsrepression und Deadenylierung und prägt damit Programme, die an Zellzykluskontrolle, Differenzierung, angeborener Immun-Signalgebung und Stressantworten beteiligt sind. Als zentraler Effektor der RNA-Interferenz beeinflusst AGO2 die Stabilität des Transkriptoms und die epigenetische Regulation über Small-RNA-Signalwege. Eine fehlregulierte AGO2-Aktivität oder eine veränderte miRNA–AGO2-Beladung wurde mit abnormen Genexpressionsnetzwerken in mehreren krankheitsrelevanten Kontexten in Verbindung gebracht, darunter onkogene Transformation und neuroentwicklungsbezogene Phänotypen, was seinen Einsatz in mechanistischen Studien zur RNA-Silenzierung stützt.

eIF2C Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen AGO2-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

eIF2C Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des AGO2-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der AGO2-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen eIF2C-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native AGO2-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von eIF2C-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des eIF2C-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem AGO2-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.