Plasmide CRISPR d'Activation (h) eIF2C: sc-400813-ACT

L’AGO2 humain (eIF2C2) code l’Argonaute-2, le cœur catalytique du complexe de silençage induit par l’ARN (RISC), qui se lie à de petits ARN afin d’orienter une répression des transcrits cibles dépendante de la séquence. AGO2 assure la régulation post‑transcriptionnelle des gènes via le clivage des ARNm guidé par les miARN et les siARN, la répression de la traduction et la désadénylation, façonnant des programmes impliqués dans le contrôle du cycle cellulaire, la différenciation, la signalisation immunitaire innée et les réponses au stress. En tant qu’effecteur central de l’interférence ARN, AGO2 influence la stabilité du transcriptome et la régulation épigénétique via les voies des petits ARN. Une activité d’AGO2 dérégulée ou une altération du chargement des miARN sur AGO2 a été associée à des réseaux d’expression génique anormaux observés dans de multiples contextes pertinents pour la maladie, notamment la transformation oncogénique et des phénotypes neurodéveloppementaux, ce qui étaye son utilisation dans des études mécanistiques du silençage par l’ARN.

eIF2C Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de AGO2 sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

eIF2C Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus AGO2 dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription AGO2, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de eIF2C. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus AGO2 natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de eIF2C au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie eIF2C dans les cellules tumorales présentant une expression de AGO2 silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.