eIF2Bα CRISPR Activation Plasmid (h): sc-404034-ACT

EIF2B1 kodiert die regulatorische Unterheit eIF2Bα des eukaryotischen Translationsinitiationsfaktors 2B (eIF2B), eines Guanin-Nukleotid-Austauschfaktors, der eIF2 durch Katalyse des GDP-zu-GTP-Austauschs reaktiviert. eIF2B integriert Signale aus der integrierten Stressantwort (ISR), indem es die Phosphorylierung von eIF2α mit einer globalen Dämpfung der Translation sowie der selektiven Translation stressresponsiver mRNAs während ER-Stress, Nährstoffmangel und viraler Belastung verknüpft. Durch die Steuerung der Initiationsrate der Translation beeinflusst eIF2Bα die Proteostase, Entscheidungen über das Zellüberleben und die metabolische Anpassung. Eine Fehlregulation der eIF2B-Aktivität ist mit neuroentwicklungsbedingten und neurodegenerativen Phänotypen assoziiert, einschließlich EIF2B-assoziierter Leukodystrophien, was EIF2B1 zu einem wichtigen Ansatzpunkt für die Untersuchung von Stresssignalgebung und Translationskontrolle in humanen Zellen macht.

eIF2Bα Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen EIF2B1-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

eIF2Bα Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des EIF2B1-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der EIF2B1-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen eIF2Bα-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native EIF2B1-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von eIF2Bα-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des eIF2Bα-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem EIF2B1-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.