EFP Double Nickase Plasmid (m): sc-432163-NIC

Mouse Trim25 kodiert EFP (TRIM25), eine RING-Typ-E3-Ubiquitin-Ligase, die die Proteinstabilität und Signalwege über ubiquitinabhängige posttranslationale Modifikationen reguliert. EFP ist an angeborenen Immun- und Entzündungssignalwegen beteiligt, indem es die Signalübertragung von Mustererkennungsrezeptoren sowie interferonstimulierte Antworten moduliert, und beeinflusst zudem den RNA-Stoffwechsel durch Interaktionen mit RNA-bindenden Proteinen. Neben der antiviralen Abwehr wird TRIM25 auch mit der Regulation des Zellzyklus und von Stressantworten in Verbindung gebracht, was es relevant für die Untersuchung kontextabhängiger Kontrolle von Transkriptionsprogrammen und Proteostase macht. Eine veränderte TRIM25-Aktivität und Störungen in Ubiquitinierungsnetzwerken sind mit Immunfehlregulation und krebsassoziierten Phänotypen verbunden, was seinen Einsatz als mechanistischen Knotenpunkt in pfadzentrierter Forschung unterstützt.

EFP Das Double-Nickase-Plasmid (m) besteht aus einem aufeinander abgestimmten Plasmidpaar, das für die hochspezifische Bearbeitung des Trim25-Lokus in mouse-Zelllinien entwickelt wurde. Jedes Plasmid exprimiert eine Cas9-D10A-Nickase und eine spezifische sgRNA, die auf entgegengesetzte DNA-Stränge innerhalb von Trim25 abzielt. Wenn sie auf benachbarte Stellen auf entgegengesetzten DNA-Strängen gerichtet sind, erzeugen die beiden Nickasen versetzte Einzelstrang-Schnitte, die zusammen einen versetzten Doppelstrangbruch erzeugen, was eine koordinierte On-Target-Aktivität beider Guides erfordert. Der resultierende DNA-Bruch wird durch endogene zelluläre Reparaturwege behoben, meist durch nicht-homologe Endverknüpfung (NHEJ), was zu Insertionen oder Deletionen führt, die die Trim25-Funktion stören. Durch die Notwendigkeit einer doppelten sgRNA-Bindung am Zielort erhöht der Doppel-Nick-Ansatz die Spezifität der Bearbeitung und bietet eine komplementäre CRISPR-Strategie für Anwendungen, bei denen eine zusätzliche Kontrolle über die Zielgenauigkeit gewünscht ist.

Um eine effiziente Identifizierung editierter Zellen zu unterstützen, kodiert ein Plasmid GFP zur fluoreszierenden Visualisierung transfizierter Populationen, während das Begleitplasmid ein Puromycin-Resistenzgen für die Antibiotika-Selektion trägt. Zusammen unterstützen diese Merkmale eine effiziente Anreicherung co-transfizierter Populationen und vereinfachen die Validierung von Klonen mit Trim25-Störung.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.