Plasmide CRISPR d'Activation (h) EF-Tu: sc-404257-ACT

TUFM code le facteur d’élongation mitochondrial humain Tu (EF-Tu), un composant central de la machinerie de traduction mitochondriale qui délivre les ARNt aminoacylés au mitoribosome de manière dépendante du GTP. En soutenant la synthèse des sous-unités de la phosphorylation oxydative codées par l’ADNmt, EF-Tu relie la production de protéines mitochondriales à l’assemblage de la chaîne respiratoire, aux flux bioénergétiques et aux programmes de protéostase tels que la réponse mitochondriale aux protéines mal repliées (UPRmt). Une altération de l’activité de TUFM peut perturber le fonctionnement de la chaîne de transport d’électrons, accroître le stress oxydant et modifier la signalisation de la mitophagie, reliant ainsi la biologie d’EF-Tu à des mécanismes largement pertinents pour la recherche sur les maladies neuromusculaires et neurodéveloppementales. Par conséquent, TUFM est souvent étudié dans des contextes impliquant une dysfonction mitochondriale, un remodelage métabolique et l’adaptation au stress.

EF-Tu Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de TUFM sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

EF-Tu Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus TUFM dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription TUFM, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de EF-Tu. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus TUFM natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de EF-Tu au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie EF-Tu dans les cellules tumorales présentant une expression de TUFM silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.