EF-1 α2 CRISPR Activation Plasmid (h): sc-401444-ACT

EEF1A2 kodiert den menschlichen Translations-Elongationsfaktor EF‑1α2, eine GTPase, die Aminoacyl‑tRNAs an die A‑Stelle des Ribosoms liefert und so eine hocheffiziente, fehlerarme Proteinsynthese unterstützt. Über seine Kernfunktion in der Translation hinaus wurde EF‑1α2 mit der Organisation des Zytoskeletts und zellulären Wachstumsprogrammen in Verbindung gebracht, indem es die Translationskapazität an Signalnetzwerke koppelt, die Proliferation, Stressanpassung und Differenzierung steuern. Eine veränderte Expression oder Aktivität von EEF1A2 wurde mit einer dysregulierten Proteostase und der Umgestaltung von Zellzuständen assoziiert, wie sie in mehreren Krankheitskontexten beobachtet wird, darunter neuroentwicklungsbezogene Phänotypen und onkogene Transformation. Daher ist EEF1A2 ein nützlicher Knotenpunkt, um die Kontrolle der Translation, die Homöostase des Proteoms und die Frage zu untersuchen, wie Veränderungen im Gleichgewicht der Elongationsfaktoren zelluläre Phänotypen neu formen.

EF-1 α2 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen EEF1A2-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

EF-1 α2 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des EEF1A2-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der EEF1A2-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen EF-1 α2-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native EEF1A2-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von EF-1 α2-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des EF-1 α2-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem EEF1A2-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.