Plasmide CRISPR d'Activation (h) EDG-4: sc-402448-ACT

LPAR2 (EDG-4) code un récepteur couplé aux protéines G pour l’acide lysophosphatidique, qui se couple principalement aux voies de signalisation Gi/Gq afin de réguler des cascades de seconds messagers contrôlant le remodelage du cytosquelette, les flux de calcium et des programmes transcriptionnels. L’activation du récepteur influence les voies Rho/ROCK, PLC/PKC, PI3K–AKT et MAPK, reliant des signaux lipidiques extracellulaires à la migration cellulaire, à la survie et aux réponses inflammatoires. Dans les cellules humaines, l’activité de LPAR2 contribue, de manière dépendante du contexte, à la régulation du comportement des cellules épithéliales et immunitaires, et elle est fréquemment étudiée dans des modèles de fibrose, de dysfonction métabolique et de signalisation du microenvironnement associé aux tumeurs. Une signalisation LPAR2/EDG-4 dérégulée a été associée à des phénotypes anormaux de prolifération et de motilité, ce qui en fait une cible pertinente pour l’analyse des voies dans des systèmes cellulaires liés à la maladie.

EDG-4 Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de LPAR2 sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

EDG-4 Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus LPAR2 dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription LPAR2, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de EDG-4. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus LPAR2 natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de EDG-4 au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie EDG-4 dans les cellules tumorales présentant une expression de LPAR2 silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.