Plasmide CRISPR d'Activation (h) EDEM3: sc-408476-ACT

EDEM3 (ER degradation enhancing alpha-mannosidase-like protein 3) est un composant résident du réticulum endoplasmique (RE) du contrôle qualité des glycoprotéines. Il participe à la dégradation associée au RE (ERAD) en favorisant la reconnaissance et l’élimination, dépendantes de la démannosylation, des N‑glycoprotéines mal repliées. En influençant la réponse aux protéines mal repliées (UPR), la protéostasie et la fidélité de la voie sécrétoire, EDEM3 contribue à réguler l’adaptation cellulaire au stress et le renouvellement de protéines clientes aberrantes. La perturbation de l’ERAD et de la protéostasie du RE est largement pertinente pour la biologie des maladies, notamment dans des contextes où un stress chronique du RE, une maturation des glycannes altérée et une dégradation des protéines dérégulée contribuent à la pathogenèse. EDEM3 humain constitue donc un nœud utile pour étudier les circuits du contrôle qualité du RE et l’homéostasie de la voie sécrétoire dans des workflows de génomique fonctionnelle et mécanistique.

EDEM3 Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de EDEM3 sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

EDEM3 Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus EDEM3 dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription EDEM3, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de EDEM3. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus EDEM3 natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de EDEM3 au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie EDEM3 dans les cellules tumorales présentant une expression de EDEM3 silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.